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导读

年7月13日，美国加州大学旧金山分校MichaelR.Wilson教授等在Nature子刊《NatureReviewsNeurology》（IF=27）上发表了一篇关于mNGS在神经中枢系统感染的应用综述。

在过去的二十年里，尽管PCR和抗原分析等病原体特异性检测取得了进展，但脑炎患者的诊断率仍然很低。流行病学研究表明，大约50%的脑炎患者没有得到病因诊断。mNGS能够以无偏倚的方式同时检测多种病原体，能够鉴定神经科医生无法鉴别诊断的病原体，包括临床上罕见的感染病原体，或者先前与临床表征并无关联的病原体，或者是新发现的病原体。

mNGS标本采集

1.采样时间

mNGS与传统的病原体特异性PCR一样容易受到限制，即如果致病原的核酸不存在于样本中，那么PCR乃至mNGS都无法检出。

对于慢性感染性脑膜脑炎患者，通常认为出现症状超过1个月，因此获得含有微生物核酸的脑脊液样本的时间窗口可能更长。然而，对于急性病毒性脑膜炎患者，病毒只在发病的最初几小时或几天存在于中枢神经系统，因此距离这类患者发作较远的时间采集的脑脊液样本可能无助于mNGS检测。

2.样本质量

脑脊液样本如在mNGS检测前已在室温下储存或在4℃下冷藏数天，微生物的核酸（尤其是RNA）可能已经降解，这可能导致mNGS产生假阴性的结果。

抗生素治疗后会降低病原体的浓度，尽管PCR和mNGS均可检测残留的微生物核酸，但对于这种情况下mNGS阴性结果的解读仍需谨慎对待。

3.感染部位

脑脊液的优势在于它是整个蛛网膜下腔微生物的来源。如果患者是局灶性感染（例如脑脓肿)，或者由于脑脊液中病原体载量低或者缺失时，血清学诊断结果为阳性（例如莱姆病、梅毒），此时的脑脊液mNGS结果为阴性时应谨慎解读。

由于这些原因，采集脑或脑膜组织活检样本进行mNGS测序也有一定的价值。当然，这取决于微生物是否存在于该组织中以及是否以无菌方式进行保存。样本如不快速冷冻，其中的DNA和RNA可能会降解。

核酸提取、文库构建及测序平台选择

1.核酸提取

在获得合适的样本后，从1ml的脑脊液样本中提取核酸（目前临床验证的分析建议至少μl，但已有基于更少的样本量进行研究的测序）。

脑脊液中的微生物载量很低，离心后提取核酸可提高胞内病原体的检出。上清液提取的核酸则更容易检出来自病毒的游离DNA。通过煮沸或玻璃珠研磨的方式提取样本中的核酸，可提高真菌和分枝杆菌的检出率。

2.文库准备

提取RNA和DNA后，进行随机扩增（在RNA反转录后），将cDNA（或提取的DNA）转化为随机cDNA或DNA片段文库，并在cDNA或DNA分子的两端连接测序接头。在高通量测序平台上进行大规模平行测序（例如Illumina）。

3.测序平台

除了二代测序外，长读长测序（三代测序，如OxfordNanopore）测序时间缩短至数小时，并且有助于得到更长和更完整的核酸片段来组装高度冗余的微生物基因组。但由于碱基错误率仍然高于短读长测序（二代测序），这降低了其在临床标本如CSF检测和感染诊断中的效能。

生物信息学分析

1.数据过滤

基于Illumina的mNGS测序的每个样本可输出5-20M的数据量（-个核苷酸）。数据分析所需的时间已从先前的几周缩短至5-20分钟。通常在分析前需要对原始数据进行过滤，包括去除宿主来源的序列，去除低复杂性的序列（高度重复的核苷酸序列无法为识别特定微生物提供依据），去除冗余和低质量的序列。

过滤去除的序列比例因组织类型以及感染病原体的丰度或环境污染程度的不同而明显不同。例如，即使在脑炎患者的受感染的CSF样本中，由于病原体载量很低，宿主来源的序列占比高达97-99%。而来自病毒性肺炎患者的痰标本中，病毒来源的序列可达80%。

2.序列比对

获得非人源、高复杂度、非冗余和高质量序列后，首先，要决定用哪一个数据库做序列比对。其次，是否先将短序列信息组装成更长的序列以进行特定的生物体比对，或者是否对原始短序列进行初始搜索；最后，需要对核苷酸比对的相对权重做出决定。

除了鉴定感染病原外，mNGS数据还能进行多种深入分析，比如进一步的系统发育分析可帮助确定患者感染的时间和地点；确定是否存在抗菌药物耐药基因；确定医院或其地理区域更广泛的疾病有关。深入分析的结果目前不是临床mNGS报告的一部分，但可与治疗医生讨论并告知，甚至可以协助启动公共卫生响应。

mNGS结果解读

首先要确定哪些是疑似感染病原体，哪些是来自皮肤定植菌群或试剂的污染。尽管脑脊液是一种无菌体液，但污染还是主要问题，由于其生物量低，可能发生试剂工程菌的过度放大，即当CSF样本中几乎没有生物量时，PCR扩增引物扩增时会反复放大即使是微量的污染，最终增加污染序列的比例。

降低污染的方法包括：通过添加已知序列的核酸片段，可减少测序试剂来源的过度污染，而不牺牲检测的敏感性；使用“无模板”（即无菌水）和非感染的脑脊液作为阴性对照可以反映实验室中存在的微生物及皮肤菌群。

因此，mNGS检出的潜在病原体必须结合临床信息，建立多学科专家团队进行分析和讨论，以确定其是否与感染有关。此外，检出序列的丰度与脑脊液中病原体的丰度有显著的相关性，但并非呈线性相关，因为可能会受诸如RNA降解、核酸提取和PCR扩增偏差等因素的影响。

病原体富集和宿主去除

1.富集技术

特定的病原体比如分枝杆菌在脑脊液中含量极低，很难检测到或者即使检测到，也可能低于宏基因组检测的报告阈值。富集技术，如脊椎动物病毒基因组捕获（VirCapSeq-VERT）、杂交富集低丰度序列（FLASH）、标记特异引物富集等，可不同程度（分别为00倍，000倍以上，10倍）地提高病原检出率，但也可能会带来一定偏向性。

2.宿主去除

在CSFmNGSRNA测序数据中，来源于人类的线粒体和核糖体RNA基因有时占样本中所有序列的50%-80%。因此，针对性去除人类RNA转录组基因，理论上可以提高感染病原体的检出，同时降低测序成本。杂交去除丰富序列（DASH）可去除不需要的宿主序列，从而反向富集病原微生物序列。考虑到宿主基因组分散分布，通过杂交有效去除人源DNA来富集病原序列仍很具挑战性，选择性去除有限数量的基因组并不能显著提高非人源序列的检出。

临床评估、实际考虑因素

1.临床评估

来自多个国家的多项研究显示，脑脊液mNGS测序与其他传统脑脊液检测的方法有很高的一致性，提高了总体诊断效率，并且对临床决策起到了积极的作用。然而，mNGS仍存在一定漏检以及因环境和人体正常定植菌污染导致的假阳性。因此，mNGS检出结果一定要结合临床进行解读，并且要考虑适时进行血清学或其他相关组织标本的检测。

2.实际考虑因素

模型研究发现，mNGS在接受过神经外科手术、危重病、艾滋病或实体器官移植的患者中具有成本效益，因为这些患者住院时间较长，花费很高。即使不考虑检测成本，在患者的诊治过程中，何时进行脑脊液mNGS测序的决定最终还是要根据具体情况来决定，如医生怀疑为一种罕见的，但常规方法难以检出，以及脑脊液样本的质量评估（采集时间、无菌采集过程、样本保存等）。

总结

文章讨论了脑脊液mNGS在脑炎、脑膜炎和脊髓炎等患者中应用的技术优势和面临的挑战。此外，还提供了建议，以帮助神经科医生和其他内科、感染病科、重症监护室和风湿病专科医生决定是否使用以及何时使用mNGS技术、如何解读阳性或者阴性结果的临床意义。

由于多种可能的感染性和自身免疫性原因，脑膜脑炎的诊断仍然具有挑战性。宏基因组二代测序(mNGS)作为一种经临床验证的病原体检测方法，能够帮助临床医生及时诊断疑似神经感染性疾病。当临床医生难以判断或常规检测方法未检出时，mNGS可提高病原体的检出率。在需要间接检测（如血清学检测）来进行诊断，以及局部感染时或者病原体绝对载量低等情况下，mNGS敏感度不高。在解读mNGS结果时，需要结合该病例的临床实际情况。环境污染可能导致假阳性，需要考虑临床实际情况。

参考文献：

RamachandranPS,WilsonMR.Metagenomicsforneurologicalinfections-expandingourimagination.NatRevNeurol.Oct;16(10):-.

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